İnsan prostat kanseri PC3 hücre hattında proteozom inhibitörlerine karşı geliştirilen direnç mekanizmalarının araştırılması

Abstract

Günümüzde kanser tedavisi için en umut vaat eden uygulama halen kemoterapi olmasına rağmen kanser ilaçlarına karşı ilaç direnci, medikal onkolojideki en büyük engel teşkil etmeye devam etmektedir. Kemoterapide meydana gelen başarısızlık sebeplerinin %90’ı, kanserde olan veya oluşan ilaç direnci ile meydana gelen invazyon ve metastazdan kaynaklanmaktadır. Tüm dünyada prostat kanseri, erkeklerde akciğer kanserinden (%14,3) sonra ikinci (%14,1) en sık görülen kanser tipidir. Ubiquitin ve proteozom yolağı (UPY) proteinler için bir kalite kontrol sistemidir. Hasarlı ve yanlış katlanmış proteinlerin yıkımından sorumludur. UPY; transkripsiyonda, hücre döngüsünde, hücre içi sinyallerde, antijen sunumunda ve epigenetik mekanizmalarda görev almaktadır. Proteozom inhibitörleri hematolojik malignitelerde kullanılmaktadır. Bortezomib bir proteozom inhibitörüdür. Proteozom inhibitörlerinin solid tümörlerde kullanılması umut vadetmektedir. Proteozom inhibitörlerinin otoimmün hastalıklarda da kullanılabileceği düşünülmektedir. Hücrelerin stres kaynaklarına verdiği yanıtlardan biri, hücrelerdeki moleküler değişiklikler ile kalıcı bir şekilde hücre döngüsü tutuklanması olan senesenstir. Senesent hücreler genellikle biyoaktif proteinler salgılarlar ve bunlar senesent olmayan komşu hücreleri uyararak tümör gelişimine sebep de olabilmektedir ve aynı zamanda yaşlanma sürecindeki kronik enflamasyondan sorumlu olduğu düşünülmektedir. Bu tezde; bir prostat kanseri hücre hattı olan PC3 hücrelerinde [PC3-P, parental; PC3-R, dirençli], klinikte prostat tedavi protokollerinde henüz kullanılmayan ve solid tümörlerde kullanılması umut vadeden bortezomib ilacına karşı oluşmuş ilaç direnci mekanizmaları ile bortezomib’in PC3 hücreleri üzerindeki senesens rolü araştırılmıştır. Dirençli PC3-R ve parental PC3-P hücrelerinde yaptığımız bortezomib sitotoksisitesi, hücre ölüm modu, AO/EB çift boyaması ve 3 boyutlu hücre kültürü çalışmalarında; PC3-R hücrelerinin PC3-P hücrelerine göre ilaca çok daha dirençli oldukları, apoptoza daha dirençli oldukları ve ilaç varlığında bile 3 boyutlu kompleks yapıları oluşturarak kendilerini destekleyebildikleri ve direnç mekanizmasının geri dönüşümlü olmadığı gösterilmiştir. Direnç mekanizmasını aydınlatmaya yönelik MAPK ve otofajik aktivasyon, ısı şok proteinlerin ekspresyonu gibi incelenen stratejik yolaklarda; stres koşullarında aktive olan ve dirence sebebiyet veren bu yolakların ve ilgili moleküllerin dirençli PC3-R hücrelerinde değil, parental PC3-P hücrelerinde bir sağkalım mekanizması olarak aktive oldukları gözlenmiştir. PC3-R hücrelerindeki bortezomib direncinin ilacın bağlandığı PSMB5 enziminde meydana gelen bir mutasyondan kaynaklanabileceği düşünülmektedir. PC3-P ve PC3-R hücrelerinde yapılan senesens deneyleri sonucunda, senesens markerlerinin bortezomib muamelesi sonucunda ekseriyetle azaldığı gözlenmiştir ve bu sebeple bortezomibin bir senolitik etkisinin olabileceği öne sürülmektedir. Buna ek olarak PC3-R hücrelerinde senesens, PC3-P hücrelerine göre daha az görülmektedir ve bunun ilaç direncine bir katkısı olabilir. Son olarak, literatüre göre ERK1 ve ERK2 proteinlerinin fonksiyonel olarak işlevlerinin aynı olup olmadığı hakkında tartışmalar vardır. Tez çalışmamızda bortezomib muamelesinden sonra ERK1 fosforilasyonlarının artarken ERK2 fosforilasyonlarının azaldığı görülmüştür. Bu olay, ERK1 ve ERK2’nin farklı regüle edilebildiğini ve bu sebeple farklı işlevler görebileceklerine işaret etmektedir.

Chemotherapy is still the most promising application for cancer treatment today. However, drug resistance to cancer drugs remains the biggest obstacle in medical oncology as 90% of the causes of failure in chemotherapy are due to invasion and metastasis caused by drug resistance in cancer. Prostate cancer is the second most common type of cancer in men (14.1%) following lung cancer (14.3%) in the world. Ubiquitin and the proteasome pathway (UPP) is a quality control system for proteins. It is responsible for the destruction of damaged and misfolded proteins. UPP is involved in transcription, cell cycle, intracellular signals, antigen presentation, and epigenetic mechanisms. Proteasome inhibitors are used in hematological malignancies. Bortezomib is a proteasome inhibitor. The use of proteasome inhibitors in solid tumors is promising. It is thought that proteasome inhibitors can also be used in autoimmune diseases. One of the cells' responses to stressors is senescence, which is a permanent cell cycle arrest by molecular changes in the cells. Senescent cells often secrete bioactive proteins, which can stimulate neighboring non-senescent cells to cause tumorigenesis and are also thought to be responsible for chronic inflammation in the aging process. Bortezomib is not yet used in prostate treatment protocols in clinics and bortezomib is promising to be used in solid tumors. In this thesis; drug resistance mechanisms against bortezomib resistance and the senescence role of bortezomib on PC3 cells were investigated in a prostate cancer cell line PC3 cells [PC3-P, parental; PC3-R, resistant]. In the studies of bortezomib cytotoxicity, cell death mode, AO/EB double staining, and 3D cell culture performed in resistant PC3-R and parental PC3-P cells; PC3-R cells were found to be much more resistant to bortezomib and apoptosis than PC3-P cells. We have shown that the PC3-R cells can support themselves by forming 3-dimensional complex structures even in the presence of bortezomib and the resistance mechanism in resistant PC3-R cells is not reversible. In the strategic pathways we examined, such as MAPK and autophagic activation, the expression of heat shock proteins for elucidating the resistance mechanism; it has been demonstrated that these pathways and their related molecules, which are activated under stress conditions and cause resistance, are more strongly activated in parental PC3-P cells and not in resistant PC3-R cells due to cell survival mechanisms. We think that bortezomib resistance may be due to a mutation in the PSMB5 enzyme to which bortezomib drug binds in the PC3-R cells. As a result of the senescence experiments performed in PC3-P and PC3-R cells, senescence markers were observed to be decreased to bortezomib treatment in general, and we, therefore, suggest that bortezomib may have a senolytic effect. Moreover, it has been observed that senescence is less common in PC3-R cells than in PC3-P cells, and this may contribute to drug resistance. Finally, according to the literature, there are debates about whether the ERK1 and ERK2 proteins are functionally the same. In this thesis study, it was observed that ERK1 phosphorylations increased while ERK2 phosphorylations decreased after bortezomib treatment. This indicates that ERK1 and ERK2 can be regulated differently and hence they may possess distinct functions.