Küçük hücreli dışı akciğer kanserinde anastazisin moleküler ve genetik mekanizmalarının araştırılması

Abstract

Ölmekte olan bir hücre, genel olarak kabul edilen 'geri dönüşü olmayan noktalara' ulaştıktan sonra hücre ölümünün eşiğinden kurtulabilir mi? Bu soru, anastazis mekanizmasının ilk adımını oluşturmakla beraber bu tezin ortaya çıkmasına da neden olmuştur. Apoptozisin tersine çevrilmesi olarak literatüre geçen anastaziste süreç, indükleyici ajanın ortamdan çıkarılmasıyla başlar. Yeni keşfedilen bir süreç olduğu için anastazisin amacı ve nasıl çalıştığı konusunda daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Bu tez çalışması, A549 hücrelerinin Paklitaksel'in neden olduğu apoptozisten kurtulabileceğini ortaya koymaktadır. İlk aşamada A549 hücrelerini anastatik hücrelere dönüştürmek için öncelikle, SRB hücre canlılık analiziyle Paklitaksel uygulaması sonrasında büyüme eğrileri oluşturularak Paklitaksel'in maksimum toksik konsantrasyonu belirlenmiştir. Ayrıca daha hassas bir yöntem olan ATP hücre canlılık analiziyle de sonuçlar doğrulanmıştır. İkinci aşamada ise Paklitaksel'in maksimum toksik konsantrasyonu kullanılarak hangi zaman aralığında anastatik hücre dönüşümünün gerçekleştiği belirlenmiştir. Apoptozisin erken ve geç aşamaları üçlü floresan boyama (Hoechst 33342, Propidyum iyodür ve Anneksin-V) yöntemiyle, Kaspaz 3/7 enzim aktivitesi de luminometrik kaspaz ölçüm kitiyle belirlenmiştir. Ek olarak, belirlenen zaman ve konsantrasyonlarda Kaspaz 3/7+ ve Propidyum iyodür- ile Kaspaz 3/7+ ve Propidyum iyodür+ hücre popülasyonlarının varlığı akış sitometrisi kullanılarak doğrulanmıştır. Bu sayede Paklitaksel'in hangi zaman ve konsantrasyonlarda hücre popülasyonun çoğunluğunda (> %80) apoptotik hücre ölümünü indüklediği tespit edilmiştir. Son aşamada ise Paklitaksel, belirtilen zaman ve konsantrasyonlarda A549 hücrelerine uygulandıktan sonra ortamdan uzaklaştırılarak anastatik hücre dönüşümü protein düzeyinde western blot, gen düzeyinde ise RT-PCR yöntemi ile araştırılmıştır. Bu tez çalışması sonucunda A549 hücrelerinin Paklitaksel kaynaklı apoptotik hücre ölümünü tersine çevirdiği gösterilmiştir. Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri hücrelerinin (A549), Paklitaksel'e bağlı apoptotik hücre ölümünü tersine çevirerek geri geldiği ve geri gelen bu (anastatik) hücrelerin mekanizmasının protein ve gen seviyesinde varlığı in vitro olarak gösterilmiştir.

Can a dying cell escape the brink of cell death after reaching the generally accepted 'points of no return'? This question constitutes the first step of the mechanism of anastasis, but also led to the emergence of this thesis. Anastasis, which has been described in the literature as a reversal of apoptosis, begins with the removal of the inducing agent from the environment. More work is needed on the purpose of anastasis and how it works, as it is a newly discovered process. This thesis study reveals that A549 cells can recover from Paclitaxel-induced apoptosis. In the first stage, in order to convert A549 cells into anastatic cells, the maximum toxic concentration of Paclitaxel was determined by creating growth curves after the application of Paclitaxel with SRB cell viability analysis. In addition, the results were confirmed by ATP cell viability analysis, which is a more sensitive method. In the second step, it was determined at what time interval anastatic cell transformation occurred by using the maximum toxic concentration of Paclitaxel. Early and late stages of apoptosis were determined by triple fluorescent staining (Hoechst 33342, Propidium iodide and Annexin-V) and Caspase 3/7 enzyme activity was determined with a luminometric caspase measurement kit. In addition, the presence of Caspase 3/7+ and Propidium iodide- and Caspase 3/7+, Propidium iodide+ cell populations at the specified times and concentrations was confirmed using flow cytometry. In this way, it has been established at what time and concentrations paclitaxel induces apoptotic cell death in the majority of the cell population (>80%). In the final stage, after applying the paclitaxel to A549 cells at the specified times and concentrations, it was removed from the environment and anastatic cell transformation was investigated by western blot at the protein level and RT-PCR method at gene level. As a result of this thesis study, it was shown that A549 cells reverse Paclitaxel-induced apoptotic cell death. It has been shown in vitro that Non-Small Cell Lung Cancer cells (A549) come back by reversing Paclitaxel-induced apoptotic cell death, and the presence of the mechanism of these returning cells (anastatic) at the protein and gene levels.