Türkiye'de yetişen Prunella L. türlerinin fenolik bileşikleri ve antioksidan aktivitelerinin incelenmesinde analitik metotlar

Abstract

Bu tez kapsamında, Türkiye'de yayılışı saptanan Lamiaceae familyasına ait Prunella L. türleri (Prunella vulgaris L., Prunella laciniata (L.) L., Prunella grandiflora L., Prunella orientalis Bornm.) için örnek hazırlama teknikleri geliştirilmiş ve örneklerde bulunan fenolik maddeler, kantitatif olarak HPLC-DAD (yüksek performanslı sıvı kromatografi-diod serili dedektör) ile belirlenmiştir. Bununla birlikte HPLC-DAD ile belirlenemeyen Prunella L. türlerinde bulunabilecek muhtemel fenolik maddeler LC-MS (sıvı kromatografi-kütle spektrometri) ile kalitatif olarak belirlenmiştir. Ayrıca hazırlanan dört bitki örneğinin tarafımızdan geliştirilen immobilize enzim yöntemle toplam fenol tayinleri yapılmış, bulunan toplam fenol değerleri Folin ve serbest enzim yöntemleri ile bulunan değerlerle karşılaştırılmıştır. Bitki örneklerinin toplam antioksidan aktivite tayinleri ABTS [2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit)] ve DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) yöntemleri ile yapılmıştır. Çok değişkenli kalibrasyon tekniklerinden PCR (temel bileşen regresyon analizi) ve PLS (kısmı en küçük kareler regresyonu) ile bitki örneklerinin toplam fenol tayinleri, PLS ve OSC-PLS (ortagonal sinyal düzeltmesi- kısmı en küçük kareler regresyonu) ile toplam antioksidan aktivite tayinleri başarılı bir şekilde yapılmıştır. Kemometrik yöntemler ile toplam fenol ve toplam antioksidan aktivite hesaplamaları yapılmadan önce verilere; optimize korelasyon düzeltmesi, merkezileştirme, sinyal düzeltme ve normalizasyon gibi işlemler uygulanmıştır. Tahmini toplam fenol değerleri Folin yöntemi ile bulunan toplam fenol değerleriyle, tahmini toplam antioksidan aktivite değerleri de ABTS/DPPH yöntemi ile bulunan toplam antioksidan aktivite değerleri karşılaştırılmıştır. Tahmini toplam fenol ve toplam antioksidan aktivite değerlerinin gerçek değerlerle uyumlu olduğu bulunmuştur. Toplam fenol ve toplam antioksidan aktivite değeri yüksek olan metanol ekstraktlarının izolasyon çalışmaları yapılmıştır. Elde edilen fraksiyon ve ekstraktların toplam fenol, toplam antioksidan aktivite tayinleri ve HPLC-DAD analizleri yapılmıştır. İzolasyon çalışmaları sonucunda Prunella L. türlerinden yüksek miktarda rutin, rosmarinik asit ve kafeik asit izole edilmiştir. Çalışmalarımız, bitkilerdeki antikanser özelliklerinin araştırılması çalışmalarının ilk basamağını oluşturduğu için gelecekte yapılacak çalışmalara kaynak olacaktır.

In this thesis, a sample preparation technique for extraction of Prunella L. species grown in Turkey (Prunella vulgaris L., Prunella laciniata (L.) L., Prunella grandiflora L., Prunella orientalis Bornm.) belonging to Lamiaceae family was developed and the contents of phenolic compounds in Prunella L. were identified by HPLC-DAD (high performance liquid chromatography-diode array dedector). The phenolic compounds not determined by HPLC-DAD were qualitatively determined by LC-MS (liquid chromatography-mass spectrometry). A new immobilized enzymatic method for determination of total phenolic content of four Prunella L. species was developed. The results were compared with those obtained by applying the Folin and the free enzymatic methods. Total antioxidant activities of Prunella L. were determined by ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)) and DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) methods. Multivariate calibration models relating the chromatographic profiles with total phenolic content and total antioxidant activity of Prunella L. extracts were constructed. Correlation optimized warping (COW), smoothing, normalization, and column centering was employed to analytical signals. The results demonstrated that the developed PCR (principal component regression) and PLS (partial least squares regression) multivariate calibration models can successfully predict the total phenolic content of Prunella L. samples. Also the results demonstrated that the developed PLS and OSC-PLS (orthogonal signal correction-partial least squares regression) multivariate calibration models can successfully predict the total antioxidant activity of Prunella L. samples. The metanol extracts of Prunella L. species exhibited strong antioxidant properties. Therefore, the phenolic compounds extracted using methanol were isolated by a lab-scale isolation system. These extracts were further purified using Sephadex LH-20 column chromatography, resulting in fractions. Total phenol contents, total antioxidant activities were determined in extracts and fractions. The isolated compounds were identified as rutin, rosmarinic acid and caffeic acid. This thesis is considered to be a bases of studies on anticarcinogenic properties of Prunella L. plants in future.