CRISPR/CAS yöntemi ile makak morpheus geninin (NPIPA1) knock-out edilmesi

Abstract

Gen duplikasyonu içinde bir gen bulunan bir DNA bölgesinin herhangi şekilde ikilenmesidir Mayoz bölünme sırasında homolog kromozomların hatalı hizalanması sonucu eşitsiz krosover olarak adlandırılan bir olay olur. Bu rekombinasyonun sonucu, değişim yerindeki kromozomlardan birinde duplikasyon, öbüründe ise bir delesyon oluşur. Segmental duplikasyonlar genomik DNA da bulunan duplikasyon bloklarıdır. Büyüklükleri tipik olarak 1-200 kb arasında değişir. İnsan genomunda, duplikasyon araştırmaları insan evriminde bilinmeyen kompleksleri ortaya çıkarmaktadır. NPIP (Nuclear Pore Interaction Protein) /Morpheus gen ailesinin primatlarda karşılaştırmalı sekans analizine bakıldığında insan–büyük maymun evrimi sırasında evrimsel bir dinamizim olduğu açıkça görülmüştür. Makak maymununda tek kopya olarak bulunmasına rağmen, insan referans sekansında 23 tane LCR16A (kromozom 16 da düşük-kopya sekansı 'a') vardır. Morpheus gen ailesi bu kadar çok duplikasyona uğramış olduğu halde fonksiyonu bilinmemektedir. Bu çalışmada amaç makak maymunundaki tek kopya olarak bulunan morpheus genini knock-out ederek fonksiyonunu araştırmaktır. Bu amaca yönelik olarak makak maymununun morpheus geni CV1 hücrelerine CRISPR/Cas metodu kullanarak knock-out edilmiştir. Mutasyonun varlığı PZR, Immuno floresan deneyi ve sekans analizi ile kontrol edilmiş ve gösterilmiştir. Mikroskopla yapılan incelemeler sonucu CV1 hücrelerinde fenotipsel farklılık görülmemiştir ancak bu ilk bulgular gen fonksiyonunun hücrelerde morfolojik bir değişikliğe sebep olmadığını göstermiştir. Bu çalışmanın devamında yapılacak olan moleküler analizlerle Morpheus gen fonksiyonu ile ilgili daha çok bilgi edinilmesi planlanmaktadır.

Gene duplication is defined as any duplication of a gene region of DNA. Duplications arise from an event termed unequal crossing-over that occurs during meiosis between misaligned homologous chromosomes. After the homologous recombination, one of chromosomes possesses two copy of the gene, while the other one has no copy of the gene. Segmental duplications are duplication blocks which are located in genomic DNA. Their sizes typically vary from 1-200 kb. Duplication research in human genome reveals unknown complexity in human evolution. The comparative analysis of human genome clearly observed that NPIP/Morpeus gene family has an evolutionary dynamism during human-great ape evolution. Even though there is only one copy of Morpheus gene in the macaque monkey genome, in human referance sequence, it has 23 LCR16a (low-copy repeat sequence `a' from chromosome 16). Although, Morpheus gene family recently expanded by duplication within human genome, the function of Morpheus gene family is not known yet. The main aim in this study is to knock-out single copy morpheus gene in macaque CV1 cells to investigate the gene function. In order to study the function of morpheus gene in macaque monkey we used CRISPR/Cas system and the presence of mutation has been verified by using different techniques including PCR, immunoflorecense analysis and sequence analysis. Our results show that Morpheus gene is succesfully knocked out. Using light microscopy, no phenotypic differeneces between mutated and normal CV1 cells observed, indicating that mutation in morpheus gene does not result in any morphologiğcal change in CV1 cells. Further molecular studies are planned in order to discover the function of Morpheus gene.