Antifungal duyarlılığın saptanmasında flow sitometri yönteminin makrodilüsyon ve E test yöntemleri ile karşılaştırılması

Abstract

Tüm dünyada invaziv fungal enfeksiyonların sıklığında ve klinik öneminde artış görülmektedir. Yaygın kullanılan antifungal ajanlara karşı direnç geliştiğini bildiren çalışmaların sayısındaki artış; antifungal tedavi ve bölgesel direnç durumlarını gösteren; kesin, klinikle uyumlu, uygulanması kolay, in vitro duyarlılık test metodlarına olan gereksinimi ortaya koymuştur. The National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)'ın önerdiği metod (M27-A2), zahmetli ve zaman alıcıdır. Bu nedenle antifungal duyarlılığı saptamada rutin kullanım için uygun değildir. Bu çalışmada Candida izolatlarının duyarlılığının saptanmasında iki alternatif metodun (E test ve flow sitometri), referans NCCLS makrodilüsyon yöntemi ile karşılaştırılması amaçlandı. Kan ve steril vücut sıvılarından izole edilen 87 farklı klinik Candida izolatı ve iki standart suşun (C parapsilosis ATCC 22019, C krusei ATCC 6258) amfoterisin B ve flukonazol duyarlılığı E test ve NCCLS referans metodları ile araştırıldı. Her iki metodla elde edilen minimal inhibitör konsantrasyonları (MİK), 24 ve 48 saat inkübasyon sonrasında değerlendirildi. E test ve makrodilüsyon yöntemi arasındaki uyum ±1 dilüsyonda amfoterisin B için %88.5; flukonazol için %77 bulundu. E test ile elde edilen MİK sonuçları, NCCLS referans metodu sonuçlarından biraz daha yüksek (genellikle 1 dilüsyon) olma eğilimindeydi. Flukonazol duyarlılık testinde her iki yöntemde de (E test ve NCCLS referans metodu) MİK end-point değerlendirme güçlüğüne neden olan trailing fenomeni ile karşılaşıldı ve bu durum özellikle C albicans ve C tropicalis izolatlarında daha belirgindi.Flow sitometri ile antifungal duyarlılığın belirlenmesinde iki farklı floresan boya (propidium iodide; PI ve FUN-1) kullanıldı. Yalnızca FUN-1 ile amfoterisin B için uyumlu sonuçlar elde edildi. Flow sitometrik test ile amfoterisin B için 24 Candida izolatında elde edilen MİK değerleri, 2 saat inkübasyon sonrasında belirlendi. NCCLS ve flow sitometri sonuçları arasında ±1 dilüsyondaki uyum, amfoterisin B için %87.5 olarak saptandı. Bu çalışma Candida türlerinin flukonazol ve amfoterisin B duyarlılığının rutin olarak tespit edilmesinde, NCCLS referans metoduna alternatif olarak E test ve flow sitometrik metodların, potansiyel değerini göstermektedir. Ancak MİK değerlerinin belirlenmesinde prosedürün tüm detaylarına uyulması ve deneyim çok önemlidir. Flow sitometrik test ile daha güvenilir ve hızlı sonuçlar elde etmek mümkündür. Ancak bu metodun standardizasyonunu sağlamak ve laboratuvar içi, laboratuvarlar arası uyumunu artırmak için ek çalışmalara ihtiyaç vardır.

All over the world, invasive fungal infections are steadily increasing in frequency and clinical importance. The increasing number of reports on resistance of fungi against commonly used antifungal drugs shows the need for a precise, clinical relevant, easy-to-perform in vitro susceptibility testing method to guide antifungal therapy and monitor local resistance patterns. The National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) method (approved reference meted M27-A2) is labor-intensive, time-consumping and therefore less suited for routine antifungal susceptibility testing. In this study we aimed to determine the performances of two alternative methods (E test and the flow cytometry methods) for testing the susceptibilities of Candida isolates compared with the reference NCCLS macrodilution method. Eightyseven different clinical Candida strains isolated from blood and steril body fluids and two standard strains ( C parapsilosis A TCC 22019, C krusei ATCC 6258) were examined for susceptibility to two antifungal agents, amphotericin B and fluconazole with E test and NCCLS reference methods. The minimal inhibitory concentrations (MIC) obtained by the two methods were read after 24 and 48 h of incubation. The level of agreement ±1 dilutions between the E test and broth macrodilution was %88.5 for amphotericine B and %77 for fluconazole. E test results tended to be slightly higher (usually 1 dilution) than the NCCLS methods results. Trailing effect which cause difficulty determination of MIC endpoints in fluconazole susceptibility testing was encountered with two methods (E test and NCCLS reference methods) and was particularly more prominent for C albicans and C tropicalis isolates.Two different fluorescent dye (propidium iodide; Pl and FUN-1) were used for flow cytometry test. Reproducible results determined only with FUN-1 for amphotericin B. Twentyfour Candida isolate MIGs obtained by the flow cytometry test were read after 2 h incubation period for amphotericin B. The agreement ±1 dilutions between NGGLS and flow cytometry methods determined %87.5 for amphotericin B. The study suggets the potential value of the E test and flow cytometric methods as an accurate alternative methods to the NGGLS reference method for routine fungal susceptibility testing of Candida species with fluconazole and amphotericin B, but the experience in determining MIGs and careful attention to the procedural details for E test are critically important. To achieve more rapid and reliable results is possible with flow cytometry test. However, it is labor intensive and requires technical equipment. Additional studies are needed to improve standardization of this method and to document intra- and inter-laboratory reproducibility.