Hasta örneklerinden izole edilen aspergillus fumigatus suşlarında azol direncinin saptanması

Abstract

Aspergillus enfeksiyonları özellikle immun baskılanmış hastalarda önemli mortalite ve morbidite nedeni olup, A. fumigatus hava yolu ile bulaşan en önemli enfeksiyon etkenidir. Azoller bu enfeksiyonlardan korunmada ve tedavide en fazla tercih edilen ilaçlardır. Ancak, A. fumigatus izolatları arasında artan oranda azol direncine, çok sayıda ülkede rastlanılmıştır. Azollerin klinikte yaygın kullanımı veya çevresel azol fungisitlere maruz kalma, kazanılmış azol direncinin olası sebeplerindendir. Azol direncinde en sık bildirilen mekanizma, ergosterol sentezinde rol alan 14-α-demetilaz enzimini kodlayan cyp51A genindeki mutasyonlardır. Bu çalışmada da, 1999-2012 yılları arasında çeşitli klinik örneklerden izole edilen A. fumigatus suşlarında azol direncinin sıklığı ve dirence sebep olan cyp51A genindeki mutasyonlar araştırılmıştır. Araştırmaya, 419 hastadan izole edilen 746 A. fumigatus suşu alındı. Tüm suşlar 4mg/L itrakonazol (ITZ) içeren Sabouraud's dekstroz agara ekilerek ITZ direnci açısından tarandı. ITZ içeren agarda üreyen suşların, ITZ'ye, vorikonazole (VOR) ve amfoterisin B'ye (AMB) in vitro duyarlılıkları "Clinical and Laboratory Standards Institute" (CLSI M38A) referans metodu kullanılarak değerlendirildi. PCR amplifikasyonu sonrası, mutasyonları belirlemek için tüm in vitro azol dirençli suşların cyp51A gen ve promotor bölgelerinin dizi analizi yapıldı. Tarama testleri ile A. fumigatus suşlarında ITZ direnci %10,2 (76/746) olarak bulundu. Dirençli suşlara 2000 yılından sonra hemen hemen her yıl (2005 hariç) rastlandı ve en yüksek direnç oranı (%24,6) 2007 yılında görüldü. İn-vitro duyarlılık testleri ile tüm suşlar AMB'ye duyarlı iken, ITZ ve VOR'e dirençli bulundu. cyp51A gen ve promotor bölgenin dizi analizi ile suşların %86,8'inde (66 izolat) TR34/L98H mutasyonu olduğu saptandı. Bu çalışma ile klinik izolatlar arasında azol dirençli A. fumigatus suşlarının bulunduğu ve bu suşlardaki esas direnç mekanizmasının zirai fungisitlerle çapraz reaksiyon sonucu oluştuğu bilenen TR34/L98H mutasyonu olduğu gösterildi. Bu çalışma TR34/L98H mutasyonunun ülkemizde gösterildiği ilk çalışma olup, 2000 yılından bu yana görülmektedir. Bu nedenle, bu bulgunun azol birleşikleri kullanırken akılda bulundurulması gerekmektedir.

Aspergillus infections are an important cause of mortality and morbidity especially in immunocompromised hosts, and Aspergillus fumigatus is one of the most prevalent airborne fungal pathogens causing infection. Azoles are the drugs of choice for prophylaxis and treatment of these infections. Recently, an increasing frequency of azole resistant A. fumigatus isolates has been described in different countries. Acquired resistance to azoles is possibly, due to widespread clinical use of azoles or through exposure to azole fungicides in the environment. The most commonly reported mechanism conferring azole resistance is the mutation of cyp51A gene which encodes 14-α-demethylase, the enzyme that has an important role in synthesis of ergosterol. In this study, we investigated the frequency of azole resistance among A. fumigatus isolates collected between 1999 and 2012 from clinical specimens and identified mutations in the cyp51A gene. Seven hundred and forty-six A. fumigatus isolates, collected from 419 patients were investigated. All isolates were screened for resistance to itraconazole (ITZ) by subculturing on Sabouraud's dextrose agar that contained 4 mg/L ITZ. For isolates that grew on ITZ containing agar, the in vitro activities of amphotericin B (AMB), itraconazole and voriconazole (VOR) were determined by using the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI-M38-A) reference method. After PCR amplification, cyp51A gene and its promoter region of all in-vitro azole resistant isolates were sequenced to determine the mutations. ITZ resistance was found in 10.2% (76/746) of A. fumigatus isolates. From the year 2000 onwards, patients were observed annually with an ITZ-resistant isolate (except 2005), with a maximum prevalence (24.6%) in 2007. According to in vitro susceptibility tests, AMB exhibited a good activity against all of them where as ITZ and VOR were resistant. Sequence analysis of the promoter region and cyp51A gene indicated the presence of TR34/L98H in 86.8% (66 isolates) of isolates. This study revealed the presence of azole resistance in our clinical isolates and the dominance of the TR34/L98H resistance mechanism supported the environmental route of cross-resistance to certain agriculture azole fungicides. This is the first study that shows TR34/L98H mutation in Turkey and azole resistance has emerged since 2000. Thus, it is important to keep these results in mind while using the azole compounds.